Ricca la fauna: tra gli uccelli sono presenti diverse specie di rapaci diurni e notturni quali il Biancone (Circaetus gallicus), il Falco pecchiaiolo (Pernis apivorus), lo Sparviero (Accipiter nisus), l'Allocco (Strix Aluco) e l'Assiolo (Otus scops). I boschi e gli arbusteti sono popolati da diverse specie di picchi, cince, tordi, luì e altre silvie, insieme a ghiandaie, tortore e colombacci. Da segnalare il raro Merlo acquaiolo (Cinclus cinclus), e lungo il fiume la presenza dei coloratissimi Gruccione (Merops apiaster) e Martin pescatore (Alcedo atthis), oltre ad aironi ed altri uccelli acquatici. Tra i mammiferi sono da ricordare l'istrice (Hystrix cristata), il Tasso (Meles meles), la Martora (Martes martes) ed altri mustelidi. Frequenti anche cinghiali e caprioli, mentre il Lupo (Canis lupus) transita occasionalmente all'interno dell'area protetta. La ricchezza e la qualità delle acque delle zone umide all'interno della Riserva è testimoniata dalla presenza della rara Tartaruga d'acqua dolce (Emys orbicularis), della Salamandrina dagli occhiali (Salamandrina tergiditata), del Granchio di fiume (Potamon fluviatile) e del Gambero di fiume (Austropotamobius pallipes).

La flora, grazie alla particolare collocazione geografica di Monte Rufeno, è particolarmente ricca. Ricordiamo, oltre a numerose specie di orchidee, il giglio rosso (Lilium bulbiferum ssp. croceum), il narciso dei poeti (Narcissus poaeticus), e l'unica stazione nel Lazio di erba scopina (Hottonia palustris), una pianta acquatica considerata vulnerabile in Italia. Troviamo, inoltre, una delle stazioni più meridionali del brugo (Calluna vulgaris), pianta rarissima nel Lazio, e una delle più settentrionali del farnetto (Quercus Frainetto) e del melo ibrido (Malus florentina). Da citare infine il frassinello (Dictamnus albus) e la crespolina etrusca (Santolina etrusca). La componente micologica è ricca e varia annoverando tra l'altro una nuova specie (Tricholoma rufenum) rinvenuta e studiata all'interno della Riserva.